TRPM8 Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-401744-LAC

TRPM8 (transient receptor potential cation channel subfamily M member 8) codifica un canale ionico permeabile al Ca2+, sensibile al freddo e al mentolo, che funge da principale rilevatore del raffreddamento ambientale e di agonisti chimici nei neuroni sensoriali e in altri tipi cellulari. L’attività di TRPM8 regola l’eccitabilità di membrana e la segnalazione del calcio intracellulare, influenzando processi a valle quali la segnalazione mediata da chinasi, le risposte trascrizionali e le vie dell’infiammazione neurogena. Oltre ai ruoli nella somatosensazione, TRPM8 è stato associato alla fisiologia epiteliale e neuronale ed è spesso studiato nel contesto della segnalazione del dolore, dei meccanismi della neuropatia periferica e delle alterazioni dell’omeostasi del calcio. Un’espressione o un’attività del canale TRPM8 disregolata è stata riportata in diversi contesti rilevanti per la malattia, a supporto del suo impiego come punto di ingresso molecolare per studi meccanicistici sulla trasduzione sensoriale e sulle reti di segnalazione Ca2+-dipendenti.

Le particelle di attivazione lentivirale TRPM8 (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di TRPM8 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale TRPM8 (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione TRPM8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di TRPM8. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo TRPM8 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.