Troponin T-SS Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402749-ACT

TNNT1 codifica la troponina T del muscolo scheletrico lento (Troponin T-SS), un componente fondamentale del complesso della troponina che ancora le subunità regolatorie alla tropomiosina sul filamento sottile e modula le interazioni actina–miosina dipendenti dal Ca²⁺. Collegando la segnalazione del calcio alla meccanica di contrazione del sarcomero, TNNT1 influenza l’assemblaggio miofibrillare, la generazione della forza contrattile e la fisiologia muscolare specifica del tipo di fibra. Alterazioni dell’espressione o della funzione di TNNT1 sono collegate a disfunzione del muscolo scheletrico e sono state associate a fenotipi di malattie neuromuscolari congenite, rendendolo rilevante per studi sulla regolazione sarcomerica, sullo sviluppo muscolare e sulle risposte allo stress associate alla contrattilità. TNNT1 è quindi ampiamente utilizzato come marcatore e come nodo meccanicistico in vie che governano l’accoppiamento eccitazione–contrazione e l’integrità delle miofibre.

Troponin T-SS Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TNNT1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Troponin T-SS Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TNNT1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TNNT1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Troponin T-SS. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TNNT1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Troponin T-SS nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Troponin T-SS nelle cellule tumorali con espressione di TNNT1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.