Troponin C Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-406429-ACT

TNNC1 codifica la troponina C cardiaca/del muscolo scheletrico a contrazione lenta, una proteina EF-hand legante Ca2+ che funge da sensore del calcio all’interno del complesso della troponina del filamento sottile, regolando l’interazione actina–miosina e la contrazione del sarcomero. In seguito al legame con Ca2+, la troponina C induce cambiamenti conformazionali che alleviano l’inibizione mediata dalla tropomiosina, collegando il segnale di eccitazione–contrazione alla generazione di forza nel muscolo striato. L’attività di TNNC1 interseca vie legate all’omeostasi del calcio e all’apparato contrattile che modellano l’assemblaggio delle miofibrille, l’energetica muscolare e la meccanotrasduzione. Un’espressione o una funzione deregolata di TNNC1 è implicata in cardiomiopatie ereditarie e fenotipi contrattile, a supporto del suo impiego in studi sulla biologia del sarcomero e sui meccanismi di malattia cardiaca.

Troponin C Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TNNC1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Troponin C Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TNNC1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TNNC1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Troponin C. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TNNC1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Troponin C nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Troponin C nelle cellule tumorali con espressione di TNNC1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.