TrkB Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400142-ACT

NTRK2 codifica la tirosin-chinasi recettoriale umana TrkB, un recettore ad alta affinità per il BDNF e per neurotrofine correlate, che controlla la differenziazione neuronale, la plasticità sinaptica e la sopravvivenza. In seguito al legame con il ligando, TrkB attiva le cascate di segnalazione PI3K–AKT, MAPK/ERK e PLCγ, che coordinano programmi trascrizionali, rimodellamento del citoscheletro e connettività dipendente dall’attività. La segnalazione di TrkB è centrale per il neurosviluppo e per il mantenimento dei circuiti; la disregolazione dell’espressione di NTRK2 o dell’accoppiamento delle vie di segnalazione è stata associata ad alterazioni della funzione neuronale in contesti di patologie neuropsichiatriche e neurodegenerative. In quanto recettore nodo nelle vie delle neurotrofine, NTRK2 è spesso studiato per i suoi effetti sulle transizioni di stato cellulare, sulle risposte allo stress e sull’espressione genica indotta da stimoli.

TrkB Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NTRK2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TrkB Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NTRK2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NTRK2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TrkB. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NTRK2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TrkB nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TrkB nelle cellule tumorali con espressione di NTRK2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.