TRIM5α Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-409348-ACT

TRIM5α (tripartite motif-containing 5 alpha) è un fattore di restrizione inducibile dagli interferoni che riconosce i capsidi dei retrovirus e blocca l’infezione tramite uno scapsidamento prematuro e la successiva inibizione della trascrizione inversa. In quanto ligasi E3 dell’ubiquitina con architettura RING–B-box–coiled-coil e un dominio PRY/SPRY che lega il capside, TRIM5α collega il riconoscimento di pattern alla segnalazione dipendente dall’ubiquitina e alla proteostasi, intersecando vie dell’immunità innata come NF-κB e le risposte citochiniche infiammatorie. Le variazioni di TRIM5 influenzano lo spettro d’ospite e la suscettibilità ai retrovirus, rendendolo un nodo ampiamente studiato nella difesa antivirale, nella regolazione immunitaria e nella coevoluzione ospite–patogeno. Una deregolazione del sensing innato e della segnalazione dell’ubiquitina che coinvolge proteine della famiglia TRIM è inoltre rilevante per patologie immunomediate e per le risposte cellulari allo stress.

TRIM5α Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TRIM5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TRIM5α Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TRIM5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TRIM5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TRIM5α. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TRIM5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TRIM5α nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TRIM5α nelle cellule tumorali con espressione di TRIM5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.