tricellulin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-414734-ACT

MARVELD2 codifica la tricellulina, una proteina di membrana con quattro domini transmembrana arricchita nelle giunzioni serrate tricellulari, dove si incontrano tre cellule epiteliali. La tricellulina contribuisce all’integrità della barriera epiteliale ed endoteliale organizzando i complessi giunzionali e regolando il flusso paracellulare, agendo in sinergia con claudine, occludina e proteine scaffold come ZO-1. Attraverso il suo ruolo nell’assemblaggio delle tight junction e nella polarità, MARVELD2 influenza processi tra cui la differenziazione epiteliale, la meccanotrasduzione e l’omeostasi tissutale. La disregolazione o le varianti genetiche di MARVELD2 sono state associate a patofisiologia legata alla barriera, incluse forme sindromiche e non sindromiche di perdita dell’udito, rendendolo rilevante per studi sugli epiteli sensoriali e sui meccanismi di malattia delle giunzioni.

tricellulin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MARVELD2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

tricellulin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MARVELD2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MARVELD2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di tricellulin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MARVELD2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da tricellulin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via tricellulin nelle cellule tumorali con espressione di MARVELD2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.