TRF1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401433-ACT

TERF1 codifica il fattore 1 di legame alle ripetizioni telomeriche (TRF1), un componente fondamentale del complesso shelterin che si lega al DNA telomerico a doppio filamento e regola l’omeostasi della lunghezza dei telomeri. TRF1 coordina la replicazione dei telomeri e la protezione delle estremità cromosomiche modulando l’accesso della telomerasi e favorendo la corretta progressione della forcella di replicazione attraverso le ripetizioni telomeriche, limitando così la fragilità telomerica e l’attivazione aberrante della segnalazione di danno al DNA. Attraverso le sue funzioni alle estremità dei cromosomi, TRF1 si interseca con le vie di stabilità del genoma, incluse le risposte al danno del DNA mediate da ATM/ATR e la segregazione cromosomica mitotica. Un’attività deregolata di TERF1/TRF1 è stata associata a fenotipi di disfunzione telomerica rilevanti per la biologia dell’invecchiamento e la genomica del cancro, in cui un mantenimento telomerico alterato contribuisce all’instabilità cromosomica.

TRF1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TERF1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TRF1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TERF1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TERF1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TRF1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TERF1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TRF1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TRF1 nelle cellule tumorali con espressione di TERF1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.