TRAP220 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400855-ACT

MED1 (TRAP220) ist eine zentrale Untereinheit des Mediator-Komplexes, der sequenzspezifische Transkriptionsfaktoren mit der RNA-Polymerase II koppelt und so die Transkriptionsinitiation sowie enhancergesteuerte Transkription koordiniert. Als Koaktivator nukleärer Rezeptoren integriert TRAP220 Signale aus hormonellen und metabolischen Signalwegen, um Programme zu regulieren, die Proliferation, Differenzierung und zelluläre Stressantworten steuern. Die MED1-abhängige transkriptionelle Kontrolle überschneidet sich mit Chromatin-Remodeling und epigenetischer Regulation und beeinflusst damit die Festlegung von Zelllinien sowie kontextabhängige onkogene Transkriptionszustände. Eine fehlregulierte MED1-Aktivität und veränderte Mediator-Signalübertragung wurden mit hormonabhängigen Krebserkrankungen und anderen Störungen in Verbindung gebracht, die durch ein Ungleichgewicht der Transkription und des Stoffwechsels gekennzeichnet sind, was MED1 zu einem nützlichen Ziel für mechanistische Untersuchungen der Transkriptionsregulation macht.

TRAP220 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MED1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TRAP220 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MED1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MED1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TRAP220-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MED1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TRAP220-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TRAP220-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MED1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.