transgelin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401343-ACT

TAGLN codifica la transgelina, una proteina legante l’actina arricchita nelle cellule muscolari lisce, che stabilizza e organizza in fasci l’actina filamentosa per sostenere l’architettura del citoscheletro, la contrattilità e la forma cellulare. La transgelina partecipa al rimodellamento del citoscheletro di actina a valle di RhoA/ROCK e di programmi di meccanotrasduzione correlati che coordinano adesione e migrazione. Le variazioni dell’espressione di TAGLN sono frequentemente utilizzate come marker di differenziazione del muscolo liscio e di switching fenotipico nei processi di rimodellamento vascolare e associati alla fibrosi. Livelli deregolati di transgelina sono stati riportati anche nella biologia dello stroma associato ai tumori e in stati cellulari invasivi, collegando la riprogrammazione del citoscheletro a comportamenti cellulari rilevanti per la malattia.

transgelin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TAGLN senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

transgelin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TAGLN nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TAGLN, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di transgelin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TAGLN nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da transgelin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via transgelin nelle cellule tumorali con espressione di TAGLN silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.