TRAF4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401930-ACT

TRAF4 (fattore associato al recettore del TNF 4) è una proteina adattatrice e una ligasi E3 dell’ubiquitina che coordina la trasduzione del segnale a valle di molteplici classi di recettori, inclusi i recettori per le citochine e i sensori dell’immunità innata. Attraverso l’ubiquitinazione regolata e funzioni di impalcatura (scaffold), TRAF4 influenza la dinamica delle vie NF-κB e MAPK, interseca la segnalazione TGF-β/SMAD e contribuisce al controllo della polarità cellulare, dell’organizzazione delle giunzioni e del comportamento migratorio. Alterazioni dell’espressione di TRAF4 o dell’equilibrio dei suoi segnali sono state riportate in contesti di infiammazione e di rimodellamento oncogenico delle vie di segnalazione, dove può modulare programmi trascrizionali legati alla plasticità epiteliale. In quanto nodo in reti di segnalazione prossimali ai recettori, TRAF4 è spesso studiata per il suo ruolo nel crosstalk tra vie, nelle risposte allo stress e in fenotipi associati a processi di invasione e metastasi.

TRAF4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TRAF4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TRAF4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TRAF4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TRAF4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TRAF4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TRAF4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TRAF4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TRAF4 nelle cellule tumorali con espressione di TRAF4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.