TRAC-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-409980-ACT

RNF125 codifica TRAC-1, una ligasi E3 dell’ubiquitina di tipo RING che modula la segnalazione immunitaria regolando il turnover dipendente dall’ubiquitinazione di proteine chiave nelle vie del recettore delle cellule T e della risposta alle citochine. Attraverso il controllo della stabilità proteica e dell’ampiezza del segnale, TRAC-1 influenza l’attivazione dei linfociti, le risposte antivirali e i programmi genici infiammatori a valle di vie quali NF-κB e la segnalazione associata agli interferoni. Alterazioni dell’espressione o della funzione di RNF125 sono state collegate a disregolazione immunitaria e a fenotipi immunitari correlati al cancro, rendendolo rilevante per lo studio dei meccanismi di sorveglianza immunitaria e delle interazioni tumore–sistema immunitario. Nei modelli cellulari umani, RNF125 viene spesso analizzato per comprendere come il sistema ubiquitina–proteasoma controlli le soglie di segnalazione e gli stati trascrizionali specifici di linea.

TRAC-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RNF125 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TRAC-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RNF125 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RNF125, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TRAC-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RNF125 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TRAC-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TRAC-1 nelle cellule tumorali con espressione di RNF125 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.