TPO Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-417243-ACT

Il gene umano **THPO** codifica la trombopoietina (TPO), una citochina secreta che rappresenta il principale regolatore della proliferazione dei megacariociti e della produzione di piastrine. La TPO segnala principalmente attraverso **MPL** per attivare le vie **JAK2/STAT5**, **PI3K/AKT** e **MAPK**, sostenendo il mantenimento delle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche e l’impegno di linea. Una deregolazione della segnalazione **THPO–MPL** è stata associata ad alterazioni dell’omeostasi piastrinica e contribuisce alla patobiologia delle neoplasie mieloproliferative e di altri disturbi dell’ematopoiesi. In quanto fattore endocrino a predominante espressione epatica, con controllo a feedback mediato dalla massa piastrinica, **THPO** costituisce un nodo sperimentale accessibile per studiare programmi trascrizionali guidati da citochine e la segnalazione della nicchia ematopoietica.

TPO Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di THPO senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TPO Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus THPO nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione THPO, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TPO. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus THPO nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TPO nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TPO nelle cellule tumorali con espressione di THPO silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.