TPCN1 Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-404943-LAC

TPCN1 (two-pore segment channel 1; TPC1) codifica un canale cationico endolisosomiale che media il rilascio di Ca²⁺ dipendente da NAADP da organelli acidi, coordinando microdomini locali di calcio che modulano il traffico vescicolare, la dinamica endosoma–lisosoma e l’eccitabilità di membrana. Accoppiando il flusso ionico al potenziale di membrana dell’organello e alla segnalazione dipendente dal pH, TPCN1 influenza processi quali l’autofagia, lo smistamento del carico endocitico e il riciclo dei recettori. L’attività di TPCN1 interseca reti di segnalazione calcio-dipendenti e vie di sensing dei nutrienti che regolano le risposte cellulari allo stress e il metabolismo. La deregolazione dell’omeostasi del calcio endolisosomiale e dei programmi di traffico associati a TPCN1 è oggetto di studio in contesti che includono neurodegenerazione, fenotipi pigmentari e metabolici, e invasione e migrazione associate al cancro.

Le particelle di attivazione lentivirale TPCN1 (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di TPCN1 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale TPCN1 (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione TPCN1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di TPCN1. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo TPCN1 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.