Tom70 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402022-ACT

TOMM70 kodiert Tom70, eine Rezeptoruntereinheit der Translokase der äußeren Mitochondrienmembran, die chaperongebundene Vorläuferproteine erkennt und deren Import in die Mitochondrien unterstützt. Durch die koordinierte Zuführung hydrophober Carrier-Proteine und weiterer nukleär kodierter mitochondrialer Proteine trägt Tom70 zur Aufrechterhaltung der mitochondrialen Proteostase, der Biogenese der Atmungskette und der metabolischen Homöostase bei. Eine Störung oder Fehlregulation TOMM70-assoziierter Importprozesse wird mit mitochondrialen Stressantworten in Verbindung gebracht, die die angeborene Immunsignalgebung, Apoptose und die zelluläre Anpassung an den Energiebedarf beeinflussen können. Eine veränderte mitochondriale Importkapazität wurde im Kontext von Neurodegeneration, kardiometabolischen Funktionsstörungen und krebsassoziiertem metabolischem Remodeling untersucht, wodurch TOMM70 ein nützlicher Knotenpunkt zur Untersuchung mitochondriengetriebener Krankheitsmechanismen ist.

Tom70 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TOMM70-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Tom70 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TOMM70-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TOMM70-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Tom70-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TOMM70-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Tom70-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Tom70-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TOMM70-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.