Tom20 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400041-ACT

Humanes **TOMM20** kodiert **Tom20**, einen zentralen Rezeptor des Translokase‑Komplexes der äußeren Mitochondrienmembran (TOM‑Komplex), der N‑terminale Targeting‑Präsequenzen erkennt und den Import nukleär kodierter Proteine in die Mitochondrien einleitet. Durch die Steuerung des mitochondrialen Proteintransports unterstützt Tom20 die oxidative Phosphorylierung, die mitochondriale Dynamik und die Proteostase und beeinflusst zelluläre Antworten auf energetischen Stress. Eine veränderte TOMM20‑Expression oder ‑Funktion wurde mit mitochondrialer Dysfunktion sowie Störungen der Apoptose und der angeborenen Immun‑Signalgebung in Verbindung gebracht, was TOMM20 für Studien zum Krebsstoffwechsel und zu Mechanismen neurodegenerativer Erkrankungen relevant macht. TOMM20 wird daher häufig als mitochondrialer Marker eingesetzt und gilt als funktioneller Knotenpunkt, der die Organellenbiogenese mit Signalwegen des Zellüberlebens verknüpft.

Tom20 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TOMM20-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Tom20 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TOMM20-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TOMM20-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Tom20-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TOMM20-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Tom20-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Tom20-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TOMM20-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.