TNAP Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400784-ACT

ALPL codifica la fosfatasi alcalina non specifica di tessuto (TNAP), un ectoenzima ancorato tramite glicosilfosfatidilinositolo (GPI) che idrolizza i monoesteri fosfato extracellulari per regolare l’equilibrio tra fosfato inorganico e pirofosfato. Controllando la disponibilità di pirofosfato e generando fosfato per la formazione dell’idrossiapatite, TNAP è un regolatore centrale dei programmi di mineralizzazione e della differenziazione degli osteoblasti, e si interfaccia con la segnalazione purinergica attraverso il metabolismo di nucleotidi come l’ATP. L’attività di TNAP influenza anche la composizione della matrice extracellulare e la propensione alla calcificazione sia nel tessuto osseo sia in quello vascolare. Una funzione disregolata di ALPL/TNAP è associata a deposizione minerale anomala e a fenotipi scheletrici, rendendola rilevante per studi di biologia dell’osso, vie di calcificazione e omeostasi del fosfato.

TNAP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ALPL senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TNAP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ALPL nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ALPL, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TNAP. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ALPL nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TNAP nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TNAP nelle cellule tumorali con espressione di ALPL silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.