TMEM97 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-411997-ACT

TMEM97 codifica una piccola proteina transmembrana multipasso, nota anche come recettore sigma-2, arricchita nel reticolo endoplasmatico e nelle membrane lisosomiali/endosomiali e implicata nella gestione intracellulare del colesterolo e nel traffico di membrana. TMEM97 è stata collegata alla regolazione della distribuzione degli steroli attraverso interazioni con complessi di trasporto lipidico e recettoriali, influenzando la dinamica vescicolare e le risposte cellulari allo stress. Un’alterata espressione di TMEM97 è stata riportata in contesti proliferativi e neurodegenerativi, in cui cambiamenti nell’omeostasi lipidica, nello stress ossidativo e nella proteostasi possono contribuire a fenotipi associati alla malattia. Queste caratteristiche rendono TMEM97 un bersaglio utile per studi meccanicistici sulla segnalazione regolata dai lipidi, sulla funzione degli organelli e sulle transizioni dello stato cellulare.

TMEM97 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TMEM97 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TMEM97 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TMEM97 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TMEM97, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TMEM97. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TMEM97 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TMEM97 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TMEM97 nelle cellule tumorali con espressione di TMEM97 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.