TMEM214 Plasmide di attivazione CRISPR (m2): sc-427183-ACT-2

Nel topo, Tmem214 codifica TMEM214, una proteina transmembrana associata al reticolo endoplasmatico, implicata nella regolazione dell’apoptosi e della segnalazione dello stress del RE. TMEM214 è stata collegata alla modulazione della risposta alle proteine mal ripiegate (unfolded protein response) e dell’omeostasi del Ca2+, influenzando le decisioni di sopravvivenza cellulare in condizioni di stress proteotossico e di alterazioni della funzione del RE. La disregolazione dello stress del RE e delle vie apoptotiche è rilevante per i meccanismi studiati nella neurodegenerazione, nelle disfunzioni metaboliche e nella biologia del cancro, rendendo Tmem214 un bersaglio utile per dissezionare questi pathway. L’editing genetico di Tmem214 in cellule murine o in modelli in vivo consente di interrogare funzionalmente il crosstalk tra stress del RE e apoptosi, i programmi trascrizionali a valle e i fenotipi di adattamento allo stress nella ricerca biomedica.

TMEM214 Il plasmide di attivazione CRISPR (m2) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Tmem214 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TMEM214 Il plasmide di attivazione CRISPR (m2) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Tmem214 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Tmem214, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TMEM214. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Tmem214 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TMEM214 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TMEM214 nelle cellule tumorali con espressione di Tmem214 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.