TMEFF2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404536-ACT

TMEFF2 (proteina transmembrana con dominio EGF-like e due domini follistatin-like 2) codifica una proteina transmembrana di tipo I implicata nella comunicazione cellula–cellula e nella segnalazione dei fattori di crescita, con effetti riportati dipendenti dal contesto su proliferazione, differenziamento e sopravvivenza cellulare. Attraverso i suoi domini extracellulari EGF-like e follistatin-like, TMEFF2 è stata associata alla modulazione di vie legate alle tirosin-chinasi recettoriali e alla regolazione di programmi trascrizionali che plasmano i comportamenti delle linee epiteliali e neurali. Un’espressione alterata di TMEFF2 è stata osservata in molteplici tipi di tumore, a supporto della sua utilità come punto di accesso molecolare per studiare stati di segnalazione associati al tumore e la plasticità di linea. Poiché TMEFF2 è localizzata alla membrana e in prossimità delle vie di segnalazione, è rilevante anche per chiarire come segnali extracellulari vengano integrati nell’attivazione delle vie a valle e nelle reti regolatorie geniche.

TMEFF2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TMEFF2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TMEFF2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TMEFF2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TMEFF2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TMEFF2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TMEFF2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TMEFF2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TMEFF2 nelle cellule tumorali con espressione di TMEFF2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.