TIGAR Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-435668-ACT

Il gene murino **Tigar** codifica **TIGAR** (TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator), un enzima di tipo fruttosio-2,6-bisfosfatasi che devia il flusso di carbonio cellulare dalla glicolisi verso la via dei pentoso fosfati riducendo i livelli di fruttosio-2,6-bisfosfato. Grazie all’aumento della produzione di NADPH e alla riduzione delle specie reattive dell’ossigeno (ROS), TIGAR sostiene l’omeostasi redox, influenza la funzione mitocondriale e modula apoptosi e autofagia in risposta a stress metabolico o genotossico. L’attività di TIGAR si interseca con la segnalazione di stress dipendente da p53, con il controllo della glicolisi e con le difese antiossidanti, risultando quindi rilevante per studi sul rimodellamento metabolico, sulle risposte infiammatorie allo stress e sul danno ossidativo in fenotipi cellulari associati a malattie. Nei modelli murini, l’alterazione dell’espressione di TIGAR viene utilizzata per indagare come il metabolismo del glucosio e il buffering dei ROS influenzino la sopravvivenza e la proliferazione cellulari, nonché l’adattamento dei tessuti.

TIGAR Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Tigar senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TIGAR Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Tigar nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Tigar, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TIGAR. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Tigar nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TIGAR nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TIGAR nelle cellule tumorali con espressione di Tigar silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.