TID-1_L/S CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404796-ACT

DNAJA3 kodiert das mitochondriale DnaJ/Hsp40-Ko-Chaperon TID-1, das als lange und kurze Isoformen (TID-1L/S) exprimiert wird und die Hsp70-abhängige Proteinfaltung, den Import sowie die Qualitätskontrolle innerhalb des Mitochondriums koordiniert. Über die Regulation der Proteostase und mitochondrialer Stressantworten beeinflusst TID-1L/S die Funktion der Atmungskette, den Umgang mit reaktiven Sauerstoffspezies und die mitochondriale Dynamik, die das Zellüberleben und die metabolische Signalgebung prägen. DNAJA3 wurde mit Signalwegen in Verbindung gebracht, die Apoptose und die Anpassung an zellulären Stress steuern, wodurch es sich als geeigneter Knotenpunkt zur Untersuchung mitochondrialer Dysfunktion in der Krebsbiologie und bei neurodegenerationsassoziierten Phänotypen anbietet. Eine Störung der TID-1L/S-Aktivität kann die mitochondriale Homöostase und nachgeschaltete Signalprogramme beeinflussen, die für proteotoxischen Stress und den Energiestoffwechsel relevant sind.

TID-1L/S Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DNAJA3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TID-1L/S Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DNAJA3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DNAJA3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TID-1L/S-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DNAJA3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TID-1L/S-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TID-1L/S-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DNAJA3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.