TID-1_L/S Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404796-ACT

DNAJA3 codifica il co‑chaperone mitocondriale DnaJ/Hsp40 TID‑1, espresso in isoforme lunga e corta (TID‑1L/S) che coordinano il ripiegamento proteico dipendente da Hsp70, l’importazione e il controllo qualità all’interno del mitocondrio. Attraverso la regolazione della proteostasi e delle risposte allo stress mitocondriale, TID‑1L/S influenza la funzione della catena respiratoria, la gestione delle specie reattive dell’ossigeno e la dinamica mitocondriale che determina la sopravvivenza cellulare e la segnalazione metabolica. DNAJA3 è stato collegato a vie che governano l’apoptosi e l’adattamento allo stress cellulare, rendendolo un nodo utile per studiare la disfunzione mitocondriale nella biologia del cancro e nei fenotipi associati alla neurodegenerazione. L’alterazione dell’attività di TID‑1L/S può modificare l’omeostasi mitocondriale e i programmi di segnalazione a valle rilevanti per lo stress proteotossico e il metabolismo energetico.

TID-1L/S Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DNAJA3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TID-1L/S Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DNAJA3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DNAJA3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TID-1L/S. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DNAJA3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TID-1L/S nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TID-1L/S nelle cellule tumorali con espressione di DNAJA3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.