Thyroglobulin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401985-ACT

TG kodiert Thyreoglobulin, ein großes sezerniertes Glykoprotein, das von follikulären Schilddrüsenzellen produziert wird und als primäres Gerüst für die Biosynthese von Schilddrüsenhormonen dient. Im Follikellumen ermöglichen Iodierung und Kopplung von Tyrosylresten auf Thyreoglobulin die Bildung von T3 und T4 und sind in den Iodtransport, die Aktivität der Thyreoperoxidase sowie TSH-gesteuerte Programme der Schilddrüsendifferenzierung eingebunden. Expression und Prozessierung von TG stehen in Zusammenhang mit der Proteinfaltung und Qualitätskontrolle im endoplasmatischen Retikulum sowie mit vesikulärem Transport, der die Thyreoglobulinsekretion und die Kolloid-Homöostase steuert. Eine Fehlregulation von TG ist mit erblichen Defekten der Schilddrüsenhormonsynthese assoziiert und ist relevant für Studien zu Schilddrüsenfunktionsstörungen, Autoantigen-Biologie und der Identität follikulärer Zellen.

Thyroglobulin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TG-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Thyroglobulin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TG-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TG-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Thyroglobulin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TG-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Thyroglobulin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Thyroglobulin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TG-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.