Thrombospondin 5 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-419759-ACT

Comp codifica la trombospondina 5 (cartilage oligomeric matrix protein, COMP), una glicoproteina secreta della matrice extracellulare, particolarmente abbondante in cartilagine e tendini, che sostiene l’assemblaggio della matrice e l’integrità meccanica dei tessuti. La trombospondina 5 partecipa alla fibrillogenesi del collagene e all’organizzazione della matrice extracellulare e influenza le interazioni cellula–matrice che modellano la differenziazione dei condrociti e lo sviluppo scheletrico. Un’alterata espressione o un ripiegamento errato di COMP sono associati a disfunzioni della placca di accrescimento, risposte da stress del reticolo endoplasmatico e rimodellamento della cartilagine legato a processi degenerativi. Nei modelli murini, Comp è ampiamente utilizzato per studiare l’omeostasi della matrice extracellulare, la meccanobiologia e le vie che contribuiscono alla patologia cartilaginea e ai fenotipi del tessuto connettivo.

Thrombospondin 5 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Comp senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Thrombospondin 5 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Comp nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Comp, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Thrombospondin 5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Comp nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Thrombospondin 5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Thrombospondin 5 nelle cellule tumorali con espressione di Comp silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.