TGase1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401487-ACT

Il gene umano **TGM1** codifica la transglutaminasi 1 (TGase1), un enzima Ca2+-dipendente che catalizza la formazione di legami crociati ε-(γ-glutamil)lisina tra proteine strutturali durante la differenziazione terminale dei cheratinociti. TGase1 è un componente fondamentale dell’assemblaggio dell’involucro corneo epidermico, integrando i segnali dei programmi di cheratinizzazione e di formazione della barriera per stabilizzare lo strato corneo. La sua attività collega le variazioni, dipendenti dalla differenziazione, nella disponibilità dei substrati con la segnalazione del calcio e la proteostasi negli strati superiori dell’epidermide. Una funzione deregolata di TGM1 è associata a patologie ereditarie che compromettono l’integrità della barriera cutanea e causano una cornificazione anomala, rendendolo un marcatore utile e un nodo meccanicistico per lo studio della differenziazione epidermica e della biologia della barriera.

TGase1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TGM1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TGase1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TGM1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TGM1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TGase1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TGM1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TGase1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TGase1 nelle cellule tumorali con espressione di TGM1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.