TFIIH p62 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402239-ACT

GTF2H1 codifica la subunità p62 di TFIIH, un componente centrale del complesso TFIIH che coordina l’inizio della trascrizione da parte dell’RNA polimerasi II con la riparazione per escissione di nucleotidi (NER). TFIIH integra l’apertura del promotore, la selezione del sito di inizio della trascrizione e il riconoscimento/la riparazione dei danni al DNA attraverso interazioni con altre subunità di TFIIH e con fattori di riparazione, collegando la trascrizione basale al mantenimento del genoma. Un’alterata funzione di TFIIH e difetti della NER sono associati a sensibilità ai raggi UV e a sindromi di riparazione accoppiata alla trascrizione, evidenziando l’importanza di p62 per le risposte cellulari allo stress genotossico. In quanto fattore di tipo “scaffold” all’interno di TFIIH, la p62 di TFIIH rappresenta un nodo sperimentalmente gestibile per analizzare il cross-talk tra la regolazione trascrizionale e le vie di riparazione del DNA.

TFIIH p62 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GTF2H1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TFIIH p62 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GTF2H1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GTF2H1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TFIIH p62. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GTF2H1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TFIIH p62 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TFIIH p62 nelle cellule tumorali con espressione di GTF2H1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.