Tenomodulin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401145-ACT

TNMD codifica la tenomodulina, una glicoproteina transmembrana di tipo II arricchita in tendini, legamenti e altri tessuti connettivi densi, dove sostiene l’omeostasi della matrice extracellulare e la maturazione tissutale. La tenomodulina è associata a programmi di differenziazione tenogenica e contribuisce alla regolazione dell’adesione cellulare, della fibrillogenesi del collagene e dei processi di rimodellamento che intersecano la segnalazione profibrotica guidata da TGF-β. Un’espressione alterata di TNMD è stata collegata a una guarigione tendinea compromessa, a tendinopatie e alla degenerazione del tessuto connettivo muscoloscheletrico; inoltre viene spesso esaminata insieme a vie legate all’angiogenesi, in virtù della riportata attività anti-angiogenica di domini della tenomodulina. Queste proprietà rendono TNMD un bersaglio utile per studiare la specificazione della linea fibroblastica, le risposte di rimodellamento contigue alla meccanotrasduzione e la biologia della matrice rilevante per la malattia in modelli cellulari umani.

Tenomodulin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TNMD senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Tenomodulin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TNMD nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TNMD, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Tenomodulin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TNMD nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Tenomodulin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Tenomodulin nelle cellule tumorali con espressione di TNMD silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.