TAP Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402586-ACT

Il gene umano NXF1 codifica TAP, un recettore centrale per l’esportazione degli mRNA che collega la trascrizione e il processamento del pre‑mRNA al trasporto attraverso i pori nucleari formando un eterodimero con NXT1 e interagendo con le nucleoporine tramite interazioni con ripetizioni FG. TAP si lega a complessi adattatori come TREX e riconosce caratteristiche degli mRNP per promuovere un’esportazione nucleare efficiente, influenzando così l’espressione genica globale, la sorveglianza dell’RNA e l’accoppiamento tra splicing ed esportazione. Attraverso il suo ruolo nel regolare la composizione e la disponibilità citoplasmatica degli mRNA, NXF1/TAP incide su vie che includono il metabolismo dell’RNA, il controllo della traduzione e programmi di espressione genica responsivi allo stress. La deregolazione della macchina di esportazione degli mRNA è stata associata ad alterazioni dell’omeostasi del trascrittoma osservate in contesti di cancro e malattie neurodegenerative, rendendo NXF1 un bersaglio rilevante per studi meccanicistici sul trasporto dell’RNA e sulla fedeltà dell’espressione genica.

TAP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NXF1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TAP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NXF1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NXF1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TAP. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NXF1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TAP nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TAP nelle cellule tumorali con espressione di NXF1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.