T1R1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403768-ACT

Il gene umano TAS1R1 codifica la subunità T1R1 del recettore eterodimerico del gusto umami (in genere in associazione con TAS1R3), che rileva L-amminoacidi e ligandi correlati. In quanto GPCR di classe C, T1R1 si accoppia ai meccanismi di trasduzione del gusto e a reti più ampie di segnalazione chemosensoriale che modulano la dinamica del calcio intracellulare e le vie dei secondi messaggeri a valle. Oltre alla gustazione, l’espressione di TAS1R1/T1R3 in tessuti extraorali sostiene la ricerca sul sensing dei nutrienti, sulla regolazione metabolica e sulla segnalazione epiteliale. Alterazioni dell’attività dei recettori chemosensoriali sono state studiate nel contesto dei comportamenti alimentari e dei fenotipi metabolici, rendendo TAS1R1 un bersaglio utile per studi meccanicistici in modelli cellulari.

T1R1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TAS1R1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

T1R1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TAS1R1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TAS1R1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di T1R1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TAS1R1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da T1R1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via T1R1 nelle cellule tumorali con espressione di TAS1R1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.