T-type Ca⁺⁺ CP α1H Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401147-ACT

CACNA1H codifica la subunità α1H formante il poro del canale del calcio voltaggio-dipendente di tipo T CaV3.2, che media un ingresso di Ca2+ attivato a bassi voltaggi e modella l’eccitabilità sotto-soglia, la scarica ritmica a raffiche e la segnalazione intracellulare dipendente dal calcio. Accoppiando la depolarizzazione di membrana a vie regolate dal Ca2+, CaV3.2 influenza il rilascio di neurotrasmettitori, la secrezione ormonale e programmi trascrizionali calcio-dipendenti in tessuti eccitabili e non eccitabili. Un’espressione o un’attività di canale aberranti di CACNA1H sono state implicate in disturbi caratterizzati da segnalazione elettrica e omeostasi del calcio alterate, inclusi fenotipi dello spettro dell’epilessia, sensibilizzazione al dolore e disturbi del ritmo cardiaco. In quanto nodo delle reti di segnalazione del calcio, CACNA1H è frequentemente studiato per il suo contributo all’eccitabilità, alla regolazione genica Ca2+-dipendente e all’accoppiamento stimolo–risposta.

T-type Ca++ CP α1H Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CACNA1H senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

T-type Ca++ CP α1H Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CACNA1H nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CACNA1H, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di T-type Ca++ CP α1H. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CACNA1H nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da T-type Ca++ CP α1H nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via T-type Ca++ CP α1H nelle cellule tumorali con espressione di CACNA1H silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.