Tβ-4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-417057-ACT

La timosina beta-4, codificata dal gene umano TMSB4X, è un peptide altamente conservato che sequestra l’actina e regola la disponibilità di G-actina, sostenendo il rimodellamento del citoscheletro, la motilità cellulare e i cambiamenti della forma cellulare in risposta allo stress. Modulando la dinamica dell’actina, influenza processi quali migrazione, adesione e risposte cellulari associate alla riparazione delle ferite, ed è stata collegata a vie di segnalazione che controllano infiammazione e rimodellamento tissutale. Un’espressione alterata di TMSB4X è stata riportata in diversi contesti, tra cui progressione tumorale, segnalazione angiogenica e stati fibrotici o infiammatori, rendendolo un nodo utile per studi meccanicistici di fenotipi dipendenti dal citoscheletro. In quanto regolatore citoscheletrico ampiamente espresso, TMSB4X rappresenta un bersaglio maneggevole per indagare come l’omeostasi dell’actina si interfacci con programmi trascrizionali e segnali provenienti dal microambiente cellulare.

Tβ-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TMSB4X senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Tβ-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TMSB4X nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TMSB4X, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Tβ-4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TMSB4X nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Tβ-4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Tβ-4 nelle cellule tumorali con espressione di TMSB4X silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.