SUR-1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-423217-ACT

Il gene murino Abcc8 codifica il recettore della sulfonilurea 1 (SUR-1), la subunità regolatoria dei canali del potassio sensibili all’ATP (KATP) che collegano lo stato energetico cellulare all’eccitabilità di membrana. Nelle cellule β pancreatiche, SUR-1 si associa a KIR6.2 per modulare l’apertura del canale in risposta al rapporto ATP/ADP, plasmando l’ingresso di calcio dipendente dalla depolarizzazione e l’accoppiamento stimolo–secrezione. Questo asse di sensing metabolico contribuisce anche all’eccitabilità dei neuroni e di altri tessuti secretori, collegando la funzione di ABCC8/SUR-1 a vie che controllano il rilascio di insulina e le risposte allo stress cellulare. Le alterazioni genetiche e funzionali della regolazione dei canali KATP sono ampiamente studiate per la loro rilevanza nei disturbi dell’omeostasi del glucosio e in fenotipi endocrini e metabolici correlati.

SUR-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Abcc8 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SUR-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Abcc8 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Abcc8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SUR-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Abcc8 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SUR-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SUR-1 nelle cellule tumorali con espressione di Abcc8 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.