Sucrase-Isomaltase Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401348-ACT

La SI umana codifica la sucrasi-isomaltasi, una glico-idrolasi di membrana del bordo a spazzola essenziale per la fase finale della digestione dei carboidrati alimentari nell’intestino tenue. Il complesso enzimatico catalizza l’idrolisi del saccarosio e dei legami α-1,4/α-1,6 negli oligosaccaridi derivati dall’amido, favorendo la disponibilità di monosaccaridi per l’assorbimento e per il metabolismo energetico dell’epitelio. L’espressione e il traffico intracellulare della SI sono strettamente connessi ai programmi di differenziamento degli enterociti e alla maturazione delle proteine della membrana apicale lungo la via secretoria. Alterazioni della funzione o dell’espressione della SI sono associate a fenotipi di deficit delle disaccaridasi e contribuiscono alla variabilità nella gestione intestinale dei carboidrati, che può influenzare stati patologici gastrointestinali.

Sucrase-Isomaltase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SI senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Sucrase-Isomaltase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SI nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SI, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Sucrase-Isomaltase. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SI nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Sucrase-Isomaltase nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Sucrase-Isomaltase nelle cellule tumorali con espressione di SI silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.