Strumpellin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402808-ACT

WASHC5 codifica Strumpellin, una subunità essenziale del complesso WASH che regola la nucleazione dell’actina dipendente da Arp2/3 sugli endosomi, controllando il rimodellamento di membrana, la tubulazione endosomiale e lo smistamento del carico recettoriale. Attraverso il suo ruolo nel riciclo dagli endosomi alla membrana plasmatica e nel traffico associato al retromero, Strumpellin influenza la disponibilità dei recettori di segnalazione, l’organizzazione del citoscheletro e la motilità cellulare. L’alterazione delle dinamiche endosomiali dipendenti da WASHC5 è stata collegata a fenotipi neurodegenerativi, inclusa la paraplegia spastica ereditaria, evidenziandone la rilevanza per il mantenimento neuronale e l’integrità degli assoni. La funzione di Strumpellin è quindi di interesse per lo studio dell’omeostasi endolisosomiale, delle dinamiche di membrana guidate dall’actina e della regolazione delle vie di segnalazione dipendente dal traffico intracellulare.

Strumpellin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di WASHC5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Strumpellin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus WASHC5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione WASHC5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Strumpellin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus WASHC5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Strumpellin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Strumpellin nelle cellule tumorali con espressione di WASHC5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.