STRAD Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402311-ACT

STRADA codifica STRAD, una pseudochinasi cataliticamente inattiva che forma un complesso con LKB1 (STK11) e con la proteina di impalcatura MO25, promuovendo la localizzazione citoplasmatica e l’attivazione di LKB1. Attraverso questo complesso, STRAD sostiene cascate di fosforilazione che influenzano la segnalazione delle chinasi correlate ad AMPK, il rilevamento dello stato energetico cellulare, la polarità e il controllo della crescita, con effetti a valle su processi quali l’organizzazione del citoscheletro e le risposte allo stress. L’alterazione o la disregolazione di STRADA è stata associata a fenotipi di neurosviluppo e a reti di segnalazione disfunzionali che intersecano vie frequentemente studiate nella biologia della proliferazione e della migrazione. Di conseguenza, STRAD viene comunemente studiata come nodo regolatorio che collega l’impalcatura delle chinasi, la localizzazione subcellulare e programmi trascrizionali dipendenti dal contesto.

STRAD Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di STRADA senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

STRAD Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus STRADA nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione STRADA, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di STRAD. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus STRADA nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da STRAD nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via STRAD nelle cellule tumorali con espressione di STRADA silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.