Stomatin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402491-ACT

Lo STOM umano codifica la stomatina, una proteina integrale di membrana arricchita nelle zattere lipidiche che modula l’organizzazione della membrana e l’attività dei canali ionici, inclusa la regolazione dei complessi di canali meccanosensibili e dei canali epiteliali del sodio. La stomatina contribuisce all’accoppiamento con il citoscheletro, al traffico vescicolare e alla segnalazione dipendente dai microdomini di membrana, influenzando il controllo del volume cellulare e le risposte allo stress. Alterazioni dell’espressione di STOM o della sua localizzazione di membrana sono state associate a difetti della membrana dei globuli rossi, come la stomatocitosi ereditaria, e possono influire sulla biomeccanica cellulare e sull’omeostasi ionica. In quanto scaffold associato alle zattere lipidiche, la stomatina è spesso studiata in vie che collegano la percezione della tensione di membrana, il trasporto ionico e l’adattamento allo stress infiammatorio o metabolico.

Stomatin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di STOM senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Stomatin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus STOM nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione STOM, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Stomatin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus STOM nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Stomatin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Stomatin nelle cellule tumorali con espressione di STOM silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.