SSAT Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402916-ACT

Il gene umano SAT1 codifica la spermidina/spermina N1-acetiltransferasi (SSAT), un enzima limitante della velocità nel catabolismo delle poliammine che acetila spermidina e spermina per favorirne l’esportazione e la riconversione ossidativa. Regolando i pool intracellulari di poliammine, SSAT influenza l’organizzazione della cromatina, i programmi trascrizionali, le risposte allo stress ossidativo e la progressione del ciclo cellulare. L’attività di SAT1 interseca la biosintesi delle poliammine e il metabolismo della metionina/di un carbonio attraverso l’utilizzo di acetil-CoA e il controllo a feedback dell’omeostasi delle poliammine. Un’espressione deregolata di SAT1 e un turnover anomalo delle poliammine sono stati associati ad alterazioni della proliferazione, della segnalazione infiammatoria, dello stress metabolico e a fenotipi legati al cancro, rendendolo un nodo utile per studi meccanicistici delle vie di segnalazione.

SSAT Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SAT1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SSAT Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SAT1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SAT1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SSAT. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SAT1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SSAT nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SSAT nelle cellule tumorali con espressione di SAT1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.