SRp40 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401886-ACT

L’SRSF5 umano codifica il fattore di splicing SRp40, una proteina legante l’RNA ricca di serina/arginina che regola lo splicing costitutivo e alternativo del pre‑mRNA e influenza la definizione degli esoni attraverso interazioni con gli enhancer di splicing esonici. SRp40 contribuisce a reti di processamento dell’RNA che accoppiano lo splicing alla trascrizione e all’esportazione dell’mRNA, determinando la scelta delle isoforme in vie che controllano la progressione del ciclo cellulare, l’apoptosi e le risposte allo stress. Un’attività o un’espressione alterata di SRSF5 può spostare l’equilibrio tra isoforme di splicing ed è stata associata a una disregolazione del metabolismo dell’RNA osservata in molteplici contesti patologici, inclusi segnali correlati al cancro e fenotipi proliferativi. In quanto nodo nella regolazione dello spliceosoma mediata dalle proteine SR, SRp40 è spesso studiata per il suo impatto sul rimodellamento del trascrittoma e sulla diversità del proteoma.

SRp40 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SRSF5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SRp40 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SRSF5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SRSF5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SRp40. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SRSF5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SRp40 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SRp40 nelle cellule tumorali con espressione di SRSF5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.