SRC-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400879-ACT

NCOA1 codifica per il coattivatore del recettore degli steroidi-1 (SRC-1), un coattivatore trascrizionale che integra la segnalazione ligando-dipendente dei recettori nucleari e di altri fattori di trascrizione per modulare l’accessibilità della cromatina e l’espressione genica guidata dalla RNA polimerasi II. SRC-1 recluta istone acetiltransferasi e ulteriori co-regolatori per coordinare programmi coinvolti nella trascrizione ormono-responsiva, nell’omeostasi metabolica, nel controllo del ciclo cellulare e nella differenziazione dello sviluppo. Attraverso il crosstalk con il recettore degli estrogeni, il recettore degli androgeni, il recettore dei glucocorticoidi e le vie responsivi ai fattori di crescita, SRC-1 contribuisce a un rimodellamento trascrizionale dipendente dal contesto. Alterazioni dell’espressione di NCOA1/SRC-1 o dell’attività del coattivatore sono state associate a una deregolazione della segnalazione endocrina e delle reti trascrizionali osservata nella biologia delle malattie associate agli ormoni, offrendo un punto d’ingresso meccanicistico per studiare la regolazione genica specifica di via.

SRC-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NCOA1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SRC-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NCOA1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NCOA1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SRC-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NCOA1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SRC-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SRC-1 nelle cellule tumorali con espressione di NCOA1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.