SR-1B Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-410541-ACT

HTR1B codifica il recettore umano della 5-idrossitriptamina 1B (SR-1B), un GPCR accoppiato a Gi/o che modula il rilascio di neurotrasmettitori e l’eccitabilità neuronale inibendo l’adenilil ciclasi, riducendo la segnalazione mediata da cAMP e regolando l’attività dei canali ionici. La segnalazione di SR-1B influenza la trasmissione sinaptica all’interno dei circuiti serotoninergici e si integra con vie che controllano il rilascio di dopamina e GABA, plasmando l’elaborazione della ricompensa, il controllo degli impulsi e le risposte allo stress. Alterazioni dell’espressione o della segnalazione di HTR1B sono state associate a fenotipi neuropsichiatrici e a endofenotipi comportamentali, a supporto del suo impiego in studi meccanicistici sulla regolazione delle vie serotoninergiche. In quanto recettore di membrana con espressione dipendente dal contesto, SR-1B rappresenta un nodo maneggevole per analizzare i programmi trascrizionali guidati dai GPCR e la dinamica dei secondi messaggeri a valle in modelli cellulari umani.

SR-1B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HTR1B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SR-1B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HTR1B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HTR1B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SR-1B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HTR1B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SR-1B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SR-1B nelle cellule tumorali con espressione di HTR1B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.