SR-1A Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401329-ACT

HTR1A codifica il recettore umano della 5-idrossitriptamina 1A (SR-1A), un GPCR accoppiato a Gi/o che regola l’eccitabilità neuronale e il rilascio di neurotrasmettitori sia come autorecettore presinaptico sia in contesti postsinaptici. La segnalazione di SR-1A sopprime l’attività dell’adenilato ciclasi riducendo l’output cAMP/PKA, coinvolge i canali GIRK e le vie MAPK/ERK e modula la dinamica del calcio per plasmare la plasticità sinaptica e la responsività allo stress. Attraverso questi processi, HTR1A è strettamente associato al funzionamento dei circuiti serotoninergici e alla regolazione neuroendocrina; alterazioni nell’espressione o nella segnalazione del recettore sono implicate nella biologia delle malattie neuropsichiatriche, inclusi i meccanismi dei disturbi dell’umore e d’ansia.

SR-1A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HTR1A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SR-1A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HTR1A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HTR1A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SR-1A. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HTR1A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SR-1A nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SR-1A nelle cellule tumorali con espressione di HTR1A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.