SQSTM1/p62 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-422075-ACT

Il gene murino *Sqstm1* codifica SQSTM1/p62, un adattatore multifunzionale che si lega ai carichi ubiquitinati e a LC3 per coordinare l’autofagia selettiva, inclusi aggrephagia e mitofagia, integrando al contempo la segnalazione della risposta allo stress. Attraverso interazioni con KEAP1, SQSTM1/p62 modula la trascrizione antiossidante dipendente da NRF2 e funge da piattaforma (scaffold) per vie come NF-κB e mTORC1, che collegano il sensing dei nutrienti a infiammazione e proteostasi. Alterazioni dell’abbondanza o del flusso di SQSTM1/p62 sono spesso utilizzate come indicatore del turnover autofagico e sono rilevanti per la ricerca su aggregazione proteica, stress ossidativo e segnalazione immunitaria nella neurodegenerazione, nella disfunzione metabolica e nella biologia dei tumori. Nei modelli murini, la perturbazione di *Sqstm1* aiuta a chiarire come l’autofagia e la segnalazione dell’ubiquitina plasmino l’omeostasi tissutale e l’adattamento allo stress.

SQSTM1/p62 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Sqstm1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SQSTM1/p62 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Sqstm1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Sqstm1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SQSTM1/p62. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Sqstm1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SQSTM1/p62 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SQSTM1/p62 nelle cellule tumorali con espressione di Sqstm1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.