Sprouty 4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402081-ACT

SPRY4 codifica Sprouty 4, un inibitore intracellulare a feedback della segnalazione delle chinasi recettoriali tirosiniche che attenua l’output a valle della via RAS–RAF–MEK–ERK/MAPK. Modulando l’intensità e la durata della segnalazione dopo la stimolazione da parte di fattori quali FGF, EGF e VEGF, Sprouty 4 influenza proliferazione, differenziamento, migrazione e morfogenesi ramificata in molteplici tipi cellulari. Alterazioni dell’espressione di SPRY4 o del suo controllo regolatorio sono state associate a reti di segnalazione dei fattori di crescita deregolate, osservate in ambito oncologico e nei disturbi dello sviluppo, rendendolo un nodo utile per studi meccanicistici delle vie di segnalazione. Il suo ruolo di freno dipendente dal contesto sulla segnalazione MAPK supporta inoltre ricerche su adattamento del segnale, architettura del feedback negativo e plasticità fenotipica.

Sprouty 4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SPRY4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Sprouty 4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SPRY4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SPRY4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Sprouty 4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SPRY4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Sprouty 4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Sprouty 4 nelle cellule tumorali con espressione di SPRY4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.