Sprouty 2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401087-ACT

SPRY2 codifica Sprouty 2, un inibitore di feedback conservato della segnalazione mediata dai recettori tirosin-chinasici (RTK) che modula gli output indotti dai fattori di crescita, come proliferazione, differenziamento e migrazione. Sprouty 2 attenua principalmente la segnalazione RAS–RAF–MEK–ERK/MAPK a valle di FGFR, EGFR e altri RTK, influenzando le interazioni tra adattatori ed effettori e plasmando così l’intensità e la durata del segnale. Attraverso queste funzioni, SPRY2 contribuisce alla regolazione di programmi di sviluppo, delle dinamiche epitelio–mesenchimali e delle risposte cellulari allo stress. Un’alterata espressione o regolazione di SPRY2 è stata associata a un’attività deregolata della via MAPK osservata in molteplici contesti rilevanti per la malattia, incluse reti di segnalazione oncogeniche e un rimodellamento tissutale aberrante.

Sprouty 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SPRY2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Sprouty 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SPRY2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SPRY2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Sprouty 2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SPRY2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Sprouty 2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Sprouty 2 nelle cellule tumorali con espressione di SPRY2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.