SPNS2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405481-ACT

SPNS2 (spinster homolog 2) codifica un trasportatore di membrana multipasso che regola la disponibilità extracellulare di sfingosina-1-fosfato (S1P), modellando gradienti di S1P che coordinano la migrazione cellulare, l’omeostasi vascolare e linfatica e il traffico delle cellule immunitarie. Controllando l’esportazione di S1P, SPNS2 influenza la segnalazione dei recettori S1P mediata da GPCR e le vie a valle, incluse PI3K/AKT, MAPK e i circuiti delle GTPasi della famiglia Rho coinvolti nella funzione di barriera e nel rimodellamento del citoscheletro. Un’attività alterata di SPNS2 è stata collegata, in sistemi sperimentali, a risposte infiammatorie deregolate e a fenotipi endoteliali/linfatici, rendendola rilevante per studi di regolazione immunitaria e biologia vascolare. In quanto nodo del metabolismo e della segnalazione degli sfingolipidi, SPNS2 è spesso studiata per il suo impatto sui segnali del microambiente tissutale e sulla comunicazione intercellulare.

SPNS2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SPNS2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SPNS2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SPNS2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SPNS2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SPNS2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SPNS2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SPNS2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SPNS2 nelle cellule tumorali con espressione di SPNS2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.