Spi-B Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402613-ACT

SPIB codifica Spi-B, un fattore di trascrizione della famiglia ETS con ruoli di rilievo nella specificazione delle linee ematopoietiche e nella maturazione delle cellule immunitarie, in particolare nei programmi delle cellule B e delle cellule dendritiche plasmacitoidi. Spi-B regola reti geniche che controllano la segnalazione del recettore dell’antigene, le risposte associate all’interferone e i circuiti trascrizionali che governano gli stati di differenziamento e di attivazione. Un’alterazione dell’espressione o dell’attività regolatoria di SPIB è stata associata a fenotipi immunitari disregolati ed è stata riportata in molteplici contesti di neoplasie ematologiche, a supporto del suo impiego come nodo molecolare per lo studio del rimodellamento trascrizionale. In quanto regolatore che lega il DNA, Spi-B offre un punto d’ingresso maneggevole per interrogare la logica di promotori/enhancer e il controllo, dipendente dalla cromatina, dell’identità di linea immunitaria.

Spi-B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SPIB senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Spi-B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SPIB nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SPIB, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Spi-B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SPIB nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Spi-B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Spi-B nelle cellule tumorali con espressione di SPIB silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.