SphK1 Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-401274-LAC

SPHK1 codifica la sfingosina chinasi 1 (SphK1), una chinasi lipidica citosolica che fosforila la sfingosina generando sfingosina-1-fosfato (S1P), un lipide di segnalazione bioattivo che regola la sopravvivenza cellulare, la proliferazione, la motilità e la segnalazione infiammatoria. Modificando l’equilibrio ceramide/sfingosina/S1P, SphK1 integra le risposte allo stress e i segnali metabolici con il rimodellamento dei lipidi di membrana e la segnalazione a valle tramite i recettori dell’S1P e gli effettori intracellulari. L’attività di SPHK1 influenza vie che includono PI3K–AKT, MAPK/ERK, NF-κB e la dinamica del citoscheletro, collegando il metabolismo degli sfingolipidi a processi associati all’angiogenesi e alla modulazione immunitaria. Un’espressione deregolata di SPHK1 o un’alterazione della segnalazione dell’S1P sono state associate a contesti di segnalazione oncogenica, fibrosi e stati infiammatori cronici, rendendolo un bersaglio utile per studiare la trasduzione del segnale mediata dai lipidi e le transizioni di stato cellulare.

Le particelle di attivazione lentivirale SphK1 (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di SPHK1 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale SphK1 (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione SPHK1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di SphK1. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo SPHK1 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.