SphK1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-423102-ACT

Sphk1 codifica la sfingosina chinasi 1 (SphK1), una chinasi lipidica citosolica che fosforila la sfingosina generando sfingosina-1-fosfato (S1P), un potente mediatore lipidico bioattivo. Modificando l’equilibrio ceramide/sfingosina/S1P, SphK1 influenza la sopravvivenza cellulare, la proliferazione, la migrazione e le risposte allo stress, e si integra con il metabolismo degli sfingolipidi, la segnalazione S1P mediata da GPCR e le cascate infiammatorie. L’attività di SphK1 è stata collegata alla regolazione del traffico di cellule vascolari e immunitarie, a programmi angiogenici e alla produzione di citochine attraverso vie che includono la segnalazione MAPK/ERK, PI3K/AKT e NF-κB. Una segnalazione SphK1/S1P deregolata è spesso studiata in contesti quali infiammazione, fibrosi, disfunzione metabolica e fenotipi associati al cancro in modelli murini.

SphK1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Sphk1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SphK1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Sphk1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Sphk1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SphK1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Sphk1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SphK1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SphK1 nelle cellule tumorali con espressione di Sphk1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.