SPATA18 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-407015-ACT

La SPATA18 umana codifica un fattore associato ai mitocondri implicato nel controllo di qualità mitocondriale e nella rimozione, sensibile allo stress, dei mitocondri danneggiati attraverso processi simili alla mitofagia. È collegata alle risposte cellulari allo stress ossidativo e al mantenimento dell’integrità della membrana mitocondriale, mettendo in relazione l’attività di SPATA18 con vie più ampie che regolano il metabolismo energetico, l’omeostasi delle specie reattive dell’ossigeno e il turnover degli organelli. Un’alterata regolazione di SPATA18 è stata riportata in contesti di stress cellulare e di programmi di mantenimento del genoma, rendendola rilevante per studi sulla disfunzione mitocondriale e su fenotipi associati alla proliferazione. Queste funzioni collocano SPATA18 come un nodo utile per indagare come la sorveglianza mitocondriale si interfacci con le decisioni sul destino cellulare e con il rimodellamento metabolico associato alle malattie.

SPATA18 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SPATA18 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SPATA18 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SPATA18 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SPATA18, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SPATA18. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SPATA18 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SPATA18 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SPATA18 nelle cellule tumorali con espressione di SPATA18 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.