Spastin Particelle di Attivazione Lentivirale (m): sc-424512-LAC

Mouse Spast codifica la spastina, un’ATPasi AAA+ con attività di taglio dei microtubuli che rimodella il citoscheletro estraendo subunità di tubulina dai reticoli polimerici. La spastina regola il trasporto assonale, la crescita dei neuriti, il traffico endosomiale e la citocinesi attraverso un controllo dinamico della stabilità dei microtubuli e interazioni con il rimodellamento di membrana associato al complesso ESCRT. Un’alterazione della funzione della spastina perturba l’organizzazione dei microtubuli neuronali e la distribuzione degli organelli, rendendo Spast un nodo chiave per lo studio di meccanismi rilevanti per il mantenimento dell’assone e la neurodegenerazione. Nei modelli murini, l’alterazione dell’attività di Spast viene comunemente sfruttata per interrogare le vie che collegano il rimodellamento del citoscheletro alla funzione sinaptica e alla vulnerabilità dei motoneuroni.

Le particelle di attivazione lentivirale Spastin (m) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di Spast in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale Spastin (m) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione Spast, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di Spastin. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo Spast e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.