SPAG17 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-410482-ACT

SPAG17 (antigene associato agli spermatozoi 17) codifica una proteina di impalcatura associata ai microtubuli, necessaria per la corretta architettura dell’assonema e per la funzione delle ciglia motili. Contribuisce all’assemblaggio e alla stabilità del complesso della coppia centrale e alle interazioni con i raggi radiali che coordinano il battito guidato dalla dineina, collegando SPAG17 all’organizzazione del citoscheletro e alle vie della ciliogenesi. Nella biologia umana, un’alterata espressione o funzione di SPAG17 è associata a difetti della motilità ciliare che possono influire sulla biologia riproduttiva e su altri tessuti dipendenti dalle ciglia. In quanto fattore regolatorio di ciglia/flagelli, SPAG17 è un utile gene marcatore per analizzare i programmi trascrizionali che governano motilità, differenziamento e dinamica dei microtubuli.

SPAG17 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SPAG17 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SPAG17 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SPAG17 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SPAG17, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SPAG17. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SPAG17 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SPAG17 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SPAG17 nelle cellule tumorali con espressione di SPAG17 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.